实时数字PCR扩增曲线的分类

罗媛媛; 姚佳; 李东书; 朱训华; 李树力; 周连群; 郭振

doi:10.37188/OPE.20212909.2178

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实时数字PCR扩增曲线的分类

微纳技术与精密机械 | 更新时间：2021-10-08

- 实时数字PCR扩增曲线的分类
- Classification of real-time digital PCR amplification curves
- 光学精密工程 2021年29卷第9期页码：2178-2188
- 作者机构：
  
  1.中国科学技术大学，安徽合肥 230026
  2.中国科学院苏州生物医学工程技术研究所国科学院生物医学检验技术重点实验室，江苏苏州 215163
  3.苏州大学电子信息学院，江苏苏州 215006
  4.复旦大学儿科医院，上海 201102
  5.季华实验室，广东佛山 528200
- 作者简介：
  
  [ "罗媛媛（1994-），女，河南信阳人，2018年于郑州大学获得学士学位，2018年攻读中国科学技术大学硕士研究生，主要从事实时数字PCR相关研究。E-mail：yyluo@mail.ustc.edu.cn罗媛媛（1994-），女，河南信阳人，2018年于郑州大学获得学士学位，2018年攻读中国科学技术大学硕士研究生，主要从事实时数字PCR相关研究。E-mail：yyluo@mail.ustc.edu.cn" ]
  [ "周连群（1981-），男，山东金乡人，研究员，博士生导师，2010年获法国Université de Franche-Comté 大学科学工程专业博士学位和中科院研究生院工学博士学位，主要研究方向：微纳生物传感器及系统。E-mail：zhoulq@sibet.ac.cn" ]
  [ "郭　振（1984-），男，宁夏隆德人，研究员，博士生导师，2011年获得中法双博士学位，主要从事微纳材料加工、制备及传感芯片研发。E-mail：guozhen@sibet.ac.cn" ]
- 基金信息：
  
  国家重点研发计划资助项目(2018YFF01011003);国家自然科学基金青年基金项目(61874133;61901469;22005331);江苏省重点研究开发项目(BE2019684;BE2018080;BE2020768);江苏省政策引导类计划(BZ2019069);季华实验室资助项目(X190181TD190);中科院青年创新促进会资助项目(2019322;2018360;201856);中国科学院科研仪器设备研制项目(YJKYYQ20200046;YJKYYQ20190057);中国科学院重大科研仪器研制项目(ZDKYYQ20210004);苏州市科技支撑计划资助项目(SYG201907);中国科学院苏州生物医学工程技术研究所自主部署项目(Y851591105;E055011301)
- DOI：10.37188/OPE.20212909.2178
  中图分类号： TP212.3
- 收稿日期：2021-03-02，
  
  修回日期：2021-04-09，
  
  纸质出版日期：2021-09-15
- 稿件说明：
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罗媛媛,姚佳,李东书等.实时数字PCR扩增曲线的分类[J].光学精密工程,2021,29(09):2178-2188.

LUO Yuan-yuan,YAO Jia,LI Dong-shu,et al.Classification of real-time digital PCR amplification curves[J].Optics and Precision Engineering,2021,29(09):2178-2188.
罗媛媛,姚佳,李东书等.实时数字PCR扩增曲线的分类[J].光学精密工程,2021,29(09):2178-2188. DOI： 10.37188/OPE.20212909.2178.

LUO Yuan-yuan,YAO Jia,LI Dong-shu,et al.Classification of real-time digital PCR amplification curves[J].Optics and Precision Engineering,2021,29(09):2178-2188. DOI： 10.37188/OPE.20212909.2178.

摘要

传统的数字PCR检测仅针对扩增终点的核酸样本执行终点式的荧光分析，依据反应后的荧光图像进行阴阳性统计及样本浓度计算，分析结果极易受假阳性及非特异性扩增影响。本文提出了一种基于过程的实时微孔式数字PCR芯片阴阳性分析方法，从时间维度对数字PCR结果进行定量分析，提高数字PCR检测的准确性。设计支持实时数字PCR分析的硬件系统并与终点式数字PCR仪进行对比，验证系统性能。在此系统上检测不同浓度的人类Ⅳ型疱疹病毒样本，获取实时扩增曲线，采用支持向量机算法对扩增曲线的特征进行学习并应用于检测曲线分类。实验结果表明，所设计的实时数字PCR系统与终点式数字PCR仪扩增结果具有高度一致性。本文所述的基于支持向量机的分类算法对扩增曲线的分类准确率达到98%以上，能准确识别假阳性及非特异性扩增微孔。相比于传统阈值分割法，本方法对阳性点识别的平均准确率提高了17.60%，并且目标模板拷贝数越低，效果越明显。与传统的终点式数字PCR相比，本文提出的基于实时数字PCR系统的数据分析方法具有准确性更高的优势，尤其在低拷贝数检测下可以获取更为精确的定量结果。

Abstract

Conventional digital PCR detection only carries out end-point fluorescence analysis for nucleic acid samples after amplification. Based on fluorescence images obtained after reactions are completed， negative and positive statistics and sample concentrations are calculated. Analysis results are easily affected by false-positives and non-specific amplification. In this paper， a real-time high-throughput digital PCR chip analysis method based on process tracking has been proposed， to quantitatively analyze digital PCR results incorporating the dimension of time， thereby improving the accuracy of digital PCR detection. A system supporting real-time digital PCR analysis was designed and compared with an end-point digital PCR instrument to verify system performance. Using this system， different concentrations of Epstein-Barr virus were detected， and real-time amplification curves were obtained. Support Vector Machine algorithms were used to learn amplification curve characteristics， and applied to classify the detection curves. The amplification results of the designed real-time digital PCR system were highly consistent with that obtained by the end-point digital PCR. The classification algorithm based on Support Vector Machine can achieve more than 98% amplification curve classification accuracy and accurately identify false-positives and non-specific amplification micro-wells. Compared with the traditional threshold segmentation method， the average accuracy of this method for positive recognition is increased by 17.60%. The lower the copy number of the target template， the more obvious this effect is. Compared with traditional end-point digital PCR， data analysis based on the real-time digital PCR system proposed in this paper offers the advantage of higher accuracy. Quantitative result accuracy is especially improved in cases of low copy number detection.

关键词

Keywords

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