浮游植物明场与荧光双光路同步成像方法 Simultaneous bright field and fluorescence dual optical path imaging of phytoplankton 1 2 first-author 徐 敏（1998-），女，河北邯郸人，硕士研究生，2020年于桂林电子科技大学获得学士学位，主要从事浮游植物显微成像方面研究，E-mail： mxu@aiofm.ac.cn http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719948&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719950&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719953&type= 22.01333237 32.00399780 徐 敏 （1998-），女，河北邯郸人，硕士研究生，2020年于桂林电子科技大学获得学士学位，主要从事浮游植物显微成像方面研究，E-mail： mxu@aiofm.ac.cn mxu@aiofm.ac.cn 1 2 corresp E-mail： gfyin@aiofm. ac. cn；njzhao@aiofm. ac. cn E-mail： gfyin@aiofm. ac. cn；njzhao@aiofm. ac. cn 殷高方（1979-），男，安徽枞阳人，博士，研究员，博士生导师，2003年于安徽师范大学获得学士学位，2011年于中国科学院安徽光学精密机械研究所获得博士学位，现为中国科学院合肥物质科学研究院安徽光学精密机械研究所研究员，主要水体浮游生物和微生物光学检测技术研究。E-mail： gfyin@aiofm.ac.cn http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719952&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719972&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719969&type= 22.01332855 32.00400162 殷高方 （1979-），男，安徽枞阳人，博士，研究员，博士生导师，2003年于安徽师范大学获得学士学位，2011年于中国科学院安徽光学精密机械研究所获得博士学位，现为中国科学院合肥物质科学研究院安徽光学精密机械研究所研究员，主要水体浮游生物和微生物光学检测技术研究。E-mail： gfyin@aiofm.ac.cn gfyin@aiofm.ac.cn 1 2 corresp E-mail： gfyin@aiofm. ac. cn；njzhao@aiofm. ac. cn E-mail： gfyin@aiofm. ac. cn；njzhao@aiofm. ac. cn 赵南京（1976-），男，安徽砀山人，博士，研究员，博士生导师，1999年于合肥工业大学获得学士学位，2005年于中国科学院安徽光学精密机械研究所获得博士学位，现为中国科学院合肥物质科学研究院安徽光学精密机械研究所研究员，主要环境光学检测技术研究。E-mail： njzhao@aiofm.ac.cn http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719975&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719958&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719978&type= 22.01332855 32.00400162 赵南京 （1976-），男，安徽砀山人，博士，研究员，博士生导师，1999年于合肥工业大学获得学士学位，2005年于中国科学院安徽光学精密机械研究所获得博士学位，现为中国科学院合肥物质科学研究院安徽光学精密机械研究所研究员，主要环境光学检测技术研究。E-mail： njzhao@aiofm.ac.cn njzhao@aiofm.ac.cn 3 3 中国科学院 合肥物质科学研究院安徽光学精密机械研究所，中国科学院环境光学与技术重点实验室，安徽 合肥 230031 中国科学院 合肥物质科学研究院安徽光学精密机械研究所，中国科学院环境光学与技术重点实验室，安徽 合肥 230031 Key Laboratory of Environment Optics and Technology， Anhui Institute of Optics and Fine Mechanics， Hefei Institutes of Physical Science， Chinese Academy of Sciences， Hefei 230031， China Key Laboratory of Environment Optics and Technology， Anhui Institute of Optics and Fine Mechanics， Hefei Institutes of Physical Science， Chinese Academy of Sciences， Hefei 230031， China 中国科学技术大学，安徽 合肥 230026 中国科学技术大学，安徽 合肥 230026 University of Science and Technology of China， Hefei 230026，China University of Science and Technology of China， Hefei 230026，China 合肥学院，安徽 合肥 230601 合肥学院，安徽 合肥 230601 Hefei University， Hefei 230601， China Hefei University， Hefei 230601， China 针对目前浮游植物种类鉴别镜检法中存在的相似形态藻细胞难以区分、同粒径杂质干扰大、藻细胞位置难以定位分割等问题，设计了一种浮游植物明场荧光显微同步成像系统。系统使用高分辨显微成像光路结构、透射式与落射式结合的照明方式和以分光光路为核心的明场荧光双光路同步成像方法，获取浮游植物显微图像下的明场形态信息和色素荧光信息。利用该系统对绿藻门、蓝藻门、硅藻门等不同门类藻种进行明场图像与荧光图像同步成像测试，实验结果表明：系统成像分辨率达1.5 μm，成像周期时间为707 ms，系统采集的图片中藻细胞纹理清晰，细胞边缘明显，利用系统中的明场图像并结合荧光图像，可有效定位藻细胞位置，降低样品中杂质对藻种鉴别的影响，丰富浮游植物显微图像信息量，为基于浮游植物显微图像的相关研究提供方法参考。 A phytoplankton bright-field fluorescence microscopic simultaneous imaging system was designed to solve the problems of the conventional phytoplankton species identification microscopy method， such as the difficulty of distinguishing between similar morphological algal cells， interference of impurities of the same particle size， and difficulty in locating and segmenting the algal cells. The proposed system uses a high-resolution microscopic imaging optical path structure， combined transmission-fall illumination method， and simultaneous bright-field fluorescence dual-optical imaging method with a spectral optical path to capture bright-field morphological and fluorescence images of phytoplankton with pigment information. The system was tested for the simultaneous acquisition of bright-field and fluorescence images of different algal species， including chlorophyta， cyanophyta， and bacillariophyta. The experimental results indicated that the imaging resolution of the system was 1.5 μm， imaging period was 707 ms， texture of algal cells in the images captured by the system was clear， and cell edges were obvious. The system using the method of combining the bright-field images with fluorescent images can effectively locate the algal cells， reduce the influence of impurities in the samples on the procedure of algae identification， and increase the amount of information obtained from the algal microscopic images. This study provides a methodological reference for related research based on phytoplankton microscopic images. 浮游植物 显微成像 荧光成像 双光路成像 phytoplankton microscopy imaging fluorescence imaging double optical path imaging 1 引 言 1 对浮游植物种类和数量进行鉴别和统计，在客观评价水生态环境富营养化状况、有效识别水生态系统退化因子等方面具有重要意义，并被广泛应用于藻类生物学、生态学 ［ 1 1 - 5 5 1-5 ］ 。目前浮游植物物种鉴定方法主要包括形态学检测法、分子标记法等 ［ 6 6 - 7 7 6-7 ］ 。形态学检测法又称显微成像法，具有识别过程直观、分类结果较准确等优点，是浮游植物鉴定及生态学研究的重要手段，但仍存在微型藻图像分辨率不足、相似形态藻细胞难以辨别、易受水中杂质干扰等问题。 浮游植物荧光图像包含丰富的浮游植物自发荧光色素信息，利用浮游植物荧光图像辅助显微图像配准识别技术，可有效排除水体杂质干扰、对藻细胞位置准确定位与轮廓分割，并进行藻体色素种类区分，提高了藻种鉴别准确率。Walker ［ 8 8 ］ 等人对藻细胞进行灰度和荧光成像定位匹配，通过算法进行鱼腥藻和微囊藻的分类识别，分类准确率可达97%以上，并可有效应用于复杂水样识别。Burkhard ［ 9 9 ］ 等人通过整合浮游植物明场、荧光显微成像信息，证明了使用浮游植物明场荧光图像对区别浮游植物和杂质、含藻蓝蛋白浮游植物与非藻蓝蛋白浮游植物具有显著优势。Deglint ［ 10 10 ］ 等人获取6个波段的藻细胞荧光图像，并通过机器学习和荧光光谱特征进行浮游植物分类识别，证明了荧光特征在识别过程中发挥了重要作用。 目前浮游植物明场-荧光显微图像获取多采用单光路的倒置荧光显微镜成像系统，通过手动操作实现明场与荧光成像模式切换，切换过程中受水体流动和活体浮游植物细胞自身游动等因素影响，显微视野下浮游植物细胞的明场图像与荧光图像存在随机错位现象，明场与荧光图像配准面临较大挑战。为获取配准对应的藻细胞明场与荧光显微图像，Bi ［ 11 11 ］ 等人利用单相机结合液晶可调谐滤波器进行浮游植物高光谱图像采集；Lauffer ［ 12 12 ］ 等人使用单相机和滤光片转轮进行明场和不同波段荧光图像采集；上述研究采用单光路显微成像技术，通过电控液晶可调谐滤波器和滤光片转轮方式提升滤波速度，但液晶响应和机械转动仍存秒级延时，难以有效解决明场与荧光图像准确匹配问题。 为此，本文将高分辨显微成像和双光路同步成像技术相结合，设计浮游植物细胞显微明场荧光成像系统，并利用绿藻门、蓝藻门、硅藻门等不同粒径和门类的浮游植物样品，对系统的成像分辨率、成像周期以及明场与荧光图像匹配效果等内容进行实验测试。 2 成像系统设计 1 2.1　成像系统总体设计 2 为了提高系统成像分辨率和明场-荧光同步成像效率，设计了如 图1 图1 所示的浮游植物明场与荧光双光路同步成像系统，系统成像光路设计遵循高分辨显微成像原则，采用分离成像光方式建立双光路成像结构并保证成像视野的统一，设计透射式明场照明和落射式荧光照明相结合的光源结构，提高光源切换效率，采用对称式光路结构保证了成像焦点的一致。系统由明场成像模块和荧光成像模块组成。明场模块由白光光源、物镜、筒镜、CMOS相机等器件组成，高分辨成像结构实现浮游植物明场图像的采集；荧光模块由两组单色光光源、物镜、分光组件、滤光组件、筒镜、COMS相机等器件组成，双波长LED搭配二向色镜组成落射式光源对藻细胞自发荧光进行激发，实现浮游植物荧光图像的采集。 2.2　高分辨显微成像光路结构设计 2 高分辨率成像光学结构是获取浮游植物清晰显微图像的基础。为得到2 μm以上粒径的微型浮游植物清晰显微图像，对 图1 图1 所示的显微系统的成像分辨率进行理论设计，该结构的成像分辨率主要取决于光学分辨率与相机分辨率。根据瑞利判据，光学分辨率 <math id="M1"><msub><mrow><mi>σ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">1</mn></mrow></msub></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719985&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719967&type= 2.87866688 3.72533321 取决于物镜数值孔径 <math id="M2"><mi>N</mi><mi>A</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719990&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45719988&type= 5.84200001 2.87866688 和照明光线波长 <math id="M3"><mi>λ</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720002&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720000&type= 1.77800000 2.79399991 ，如 式（1） 式（1） 所示： <math display="block" id="M4"><msub><mrow><mi>σ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">1</mn></mrow></msub><mo>=</mo><mn mathvariant="normal">0.61</mn><mi>λ</mi><mo>/</mo><mi>N</mi><mi>A</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720009&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720005&type= 24.46866608 4.14866638 . 相机分辨率 <math id="M5"><msub><mrow><mi>σ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msub></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720105&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720104&type= 2.87866688 3.72533321 主要由物镜放大倍率 <math id="M6"><mi>B</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720111&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720096&type= 2.53999996 2.79399991 和相机像元尺寸 <math id="M7"><mi>I</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720095&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720094&type= 1.60866666 2.79399991 决定，如 式（2） 式（2） 所示；当共轭距为无限远时，物镜放大倍率 ［ 13 13 ］ <math id="M8"><mi>B</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720111&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720096&type= 2.53999996 2.79399991 取决于物镜焦距 <math id="M9"><msub><mrow><mi>F</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">1</mn></mrow></msub></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720039&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720037&type= 3.72533321 3.72533321 和筒镜焦距 <math id="M10"><msub><mrow><mi>F</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msub></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720018&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720041&type= 3.72533321 3.72533321 ，如 式（3） 式（3） 所示： <math display="block" id="M11"><msub><mrow><mi>σ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msub><mo>=</mo><mn mathvariant="normal">2</mn><mi>I</mi><mo>/</mo><mi>B</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720045&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720044&type= 15.07066536 4.14866638 ， <math display="block" id="M12"><mi>B</mi><mo>=</mo><msub><mrow><mi>F</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msub><mo>/</mo><msub><mrow><mi>F</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">1</mn></mrow></msub></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720019&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720047&type= 16.76399994 4.14866638 . 为使成像系统整体达到光学上的极限分辨率，相机所获得的图像分辨率需与物镜分辨率匹配，整体成像分辨率受两者中最大分辨率影响，系统相机图像分辨率应低于光学分辨率。此外，为了使物镜与筒镜之间的距离合理，若成像区域尺寸为 <math id="M13"><mi>ϕ</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720052&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720049&type= 2.20133328 3.64066648 ，则物镜与筒镜的间距 <math id="M14"><mi>L</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720098&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720112&type= 2.45533323 2.79399991 需满足 公式（4） 公式（4） 和 式（5） 式（5） ，其中 <math id="M15"><msub><mrow><mi>ϕ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">1</mn></mrow></msub></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720057&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720026&type= 3.38666677 4.57200003 为物镜出瞳直径， <math id="M16"><msub><mrow><mi>ϕ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msub></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720061&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720059&type= 3.38666677 4.57200003 为筒镜入瞳直径。 <math display="block" id="M17"><msub><mrow><mi>ϕ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">1</mn></mrow></msub><mo>=</mo><mn mathvariant="normal">2</mn><mtext> </mtext><msub><mrow><mi>F</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">1</mn></mrow></msub><mo>×</mo><mi>N</mi><mi>A</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720065&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720063&type= 25.06133461 4.57200003 ， <math display="block" id="M18"><mi>L</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mo stretchy="false">(</mo><msub><mrow><mi>ϕ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msub><mo>-</mo><msub><mrow><mi>ϕ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">1</mn></mrow></msub><mo stretchy="false">)</mo><msub><mrow><mi>F</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msub></mrow><mrow><mi>ϕ</mi></mrow></mfrac></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720069&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720067&type= 27.00866890 9.05933285 . 以此显微成像方法为基础，根据2 μm以上微型浮游植物清晰图像需要，对不同器件之间的关系进行器件搭配和参数选型，构建显微成像光路系统。显微成像光路以物镜、筒镜、相机为基本成像单元，为实现藻细胞的清晰放大，系统选用40倍无穷远校正超长工作距离物镜，为使系统有效放大倍率 <math id="M19"><mi>B</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720111&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720096&type= 2.53999996 2.79399991 达到40倍，选择筒镜焦距与物镜焦距满足 公式（3） 公式（3） 中的比例关系。已知明场光源取可见光平均波长 <math id="M20"><mi>λ</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720080&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720078&type= 1.77800000 2.79399991 为550 nm，浮游植物自发荧光中心波长 <math id="M21"><mi>λ</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720080&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720078&type= 1.77800000 2.79399991 为680 nm，物镜数值孔径为0.6，代入 公式（1） 公式（1） 可得光学分辨率 <math id="M22"><msub><mrow><mi>σ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">1</mn></mrow></msub></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720109&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720108&type= 2.87866688 3.72533321 。为使系统整体分辨率达到光学分辨率 <math id="M23"><msub><mrow><mi>σ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">1</mn></mrow></msub></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720087&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720027&type= 2.87866688 3.72533321 ，且使 <math id="M24"><msub><mrow><mi>σ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow></msub></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720105&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720104&type= 2.87866688 3.72533321 < <math id="M25"><msub><mrow><mi>σ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">1</mn></mrow></msub></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720109&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720108&type= 2.87866688 3.72533321 ，将 <math id="M26"><msub><mrow><mi>σ</mi></mrow><mrow><mn mathvariant="normal">1</mn></mrow></msub></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720109&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720108&type= 2.87866688 3.72533321 和 <math id="M27"><mi>B</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720111&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720096&type= 2.53999996 2.79399991 代入 公式（2） 公式（2） 可得系统选用明场相机像元尺寸 <math id="M28"><mi>I</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720095&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720094&type= 1.60866666 2.79399991 应小于11.18 μm，荧光相机像元尺寸 <math id="M29"><mi>I</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720095&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720094&type= 1.60866666 2.79399991 应小于13.83 μm。成像器件之间的距离也将影响显微成像质量，筒镜与相机之间距离需为筒镜焦距，方可保证相机对样品的成像放大倍率为 <math id="M30"><mi>B</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720111&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720096&type= 2.53999996 2.79399991 ；根据 式（4） 式（4） 、 式（5） 式（5） ，物镜与筒镜之间距离需小于 <math id="M31"><mi>L</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720098&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720112&type= 2.45533323 2.79399991 ，方可保证在此间距内增加光学元件不影响成像质量。此外清晰成像需要稳定且较高的光通量，系统采用大功率暖白光LED和聚光透镜作为明场成像光源，采用中心波长可激发藻细胞中叶绿素和藻蓝蛋白荧光的465 nm和620 nm大功率单色LED和平凸透镜作为荧光成像光源。经过以上设计综合计算获得该明场与荧光成像系统理论分辨率分别可达0.56 μm，0.69 μm，满足微型浮游植物高分辨成像要求。 2.3　明场-荧光双光路同步显微成像结构设计 2 在高分辨显微成像结构基础上，设计透射式和落射式成像方式结合的明场-荧光同步成像结构（ 图1 图1 ）。为分离成像光并保证明场与荧光成像视野一致，双光路使用同一物镜收集光线，然后通过分光器件将明场成像光路与荧光成像光路分开，保证不同成像光路位置的独立和成像的同步。采用分光棱镜作为分光器件进行比例分光只影响光强度，对光波长和成像质量无影响，并使成像光由棱镜投射面进入荧光光路，由棱镜反射面进入明场光路，实现光路分离。 为提高不同成像模式下光源切换速度，光源均使用LED作为发光元件，响应时间可达纳秒级别，为减少机械转动时延，成像中搭建透射式落射式结合的照明结构。明场成像模块设计透射式照明结构，明场光源固定于样品下方。荧光成像模块搭建落射式结构，为使光线偏转且不影响荧光收集效果，使用二向色镜对光线方向进行偏转，光线准直后平行入射，经二向色镜偏转后垂直落射于物镜。选用D470/685 nm和D620/660 nm二向色镜，为荧光成像提供稳定光源。为滤除激发光对荧光成像的干扰，选用BP675/10K窄带滤光片，中心波长为675 nm。 图2 图2 为荧光成像选用的红蓝LED在不同波段的发光强度和二向色镜、滤光片的不同波长通过率，可知红蓝LED在红蓝二向色镜下通过率较低，可以较好的进行光线偏转，藻细胞自发荧光680 nm波段可透过二向色镜及滤光片，进行荧光成像（彩图见期刊电子版）。 为保证光路中明场相机与荧光相机对藻细胞聚焦效果一致，设计光路结构使明场与荧光光路中物镜、筒镜和相机的位置距离对称统一，保证物镜成像光到达各相机的光程一致，使各相机成像在同一焦平面。 经过上述设计，系统明场成像流程为使用白光光源照射样品台，藻细胞成像光线由物镜收集，经过分光棱镜反射进入明场成像光路，成像光线由筒镜聚焦后到达明场相机，获得浮游植物明场显微图像；系统荧光成像流程为使用465 nm，620 nm激光光源分别对样品进行激发，藻细胞产生自发荧光由物镜收集，通过分光棱镜透射后穿过二向色镜、滤光片，由筒镜聚焦后到达荧光相机，获得浮游植物荧光显微图像。 3 分析与讨论 1 3.1　实验材料与方法 2 为了测试系统实际成像性能，利用成像系统对不同种类、不同粒径的藻种进行显微图像采集，选用盘星藻（Pediastrum）、多甲藻（Peridinium）、直链藻（Melosira）、栅藻（Scenedesmus）、念珠藻（Nostoc）和铜绿微囊藻（M.aeruginosa）为不同门类实验藻种，藻种信息如 表1 表1 所示，藻种均来自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，将实验藻液进行显微制片后放置载物台，系统使用图像捕获软件控制不同光源开关和不同相机进行明场荧光显微图像拍摄与保存，获取浮游植物显微图像。 Algal Phylum Algal cell width/μm Pediastrum Chlorophyta >20 Peridinium Pyrrophyta >20 Melosira Bacillariophyta 10~20 Scenedesmus Chlorophyta 5~10 Nostoc Cyanophyta <5 M.aeruginosa Cyanophyta <5 3.2　成像系统分辨率与明场成像质量分析 2 光学成像系统的分辨率是验证成像系统质量的重要指标，通常以每毫米中可以清晰分辨的线对数（lp/mm）来表示光学成像系统分辨率的大小。系统光路成像实验的分辨率测试使用USAF 1951分辨率板进行系统的实际分辨率测试 ［ 14 14 ］ ，为对比不同方案下的成像效果差异，采用分辨率板进行不同物镜和筒镜组合成像测试，已知40倍与20倍物镜焦距均为5 mm，如 图3 图3 （a）所示为40倍物镜和100 mm焦距筒镜成像结果，如 图3 图3 （b）所示为20倍物镜和200 mm焦距筒镜成像结果，如 图3 图3 （c）所示为40倍物镜和200 mm焦距筒镜成像结果，对三种组合成像图像中的方框部分使用刃边法 ［ 15 15 ］ 进行MTF（传递调制函数）曲线分析结果如 图3 图3 （d）所示，MTF值越接近1，其成像质量越好，取MTF=0.5，此时（a），（b），（c）组合可以清晰分辨的线对数分别约为245 lp/mm，270 lp/mm和560 lp/mm，可知本系统采用的40倍物镜搭配200 mm焦距筒镜的成像方案，优于其他两种成像组合。 为进一步测试分辨率情况，使用更高精度分辨率板，并由 图4 图4 可知测得清晰度极限组数 G 和元素E为第9大组第3元素，其分辨率 R 如 公式（6） 公式（6） 所示： <math display="block" id="M32"><mi>R</mi><mo>=</mo><msup><mrow><mn mathvariant="normal">2</mn></mrow><mrow><mi>G</mi><mo>+</mo><mo stretchy="false">(</mo><mi>E</mi><mo>-</mo><mn mathvariant="normal">1</mn><mo stretchy="false">)</mo><mo>/</mo><mn mathvariant="normal">6</mn></mrow></msup></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720124&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=45720123&type= 22.01333237 3.04800010 . 可得成像系统分辨率为645 lp/mm，即每1 mm的可分辨线对数为645，条纹宽度为0.78 μm，根据瑞利判据，光学系统中分辨率极限为可分辨两点的最小间距，即线对的宽度1.56 μm，且根据 图3 图3 （d）中MTF曲线，在645 lp/mm处MTF值大于0.3，满足微型藻细胞显微成像所需分辨率要求。 为检验系统获取藻细胞明场显微图像质量，系统采集盘星藻、多甲藻、直链藻、念珠藻、栅藻、铜绿微囊藻等不同粒径藻种明场图像如 图5 图5 所示（彩图见期刊电子版），盘星藻为绿色辐射状群体，多甲藻为黄绿椭圆形单细胞，直链藻为黄绿色圆柱形壳面组成的长链，念珠藻为蓝绿色单细胞串成的念珠形组织，栅藻为绿色栅栏状细胞的组合群体，铜绿微囊藻为蓝绿色球形藻细胞。明场显微图像中不同藻细胞粒径从大于20 μm到小于5 μm，获取的藻细胞色彩分明，细胞边缘清晰可见，形态特征差异明显，实现了藻细胞丰富形态信息的获取。 3.3　浮游植物同步成像实验结果与分析 2 系统采用双光路结构，通过控制激发光源与相机开关时序，能够在数毫秒内完成明场与荧光成像光路切换，因此双光路成像速度只取决于各相机曝光时间。系统所选用相机拥有自动曝光功能，自动曝光质量由环境亮度、曝光时间、信号增益和光圈大小决定，为测试不同曝光状态下藻细胞成像性能，选用盘星藻为实验藻种，盘星藻细胞轮廓清晰，整体由多个小细胞组合而成，方便进行形态观察，确定最佳成像曝光时间，实验中保持LED光源功率不变，拍摄不同曝光时间下的同一藻细胞明场与荧光显微图像如下 图6 图6 所示。 由图 6 6 （a）， 6 6 （e）和 6 6 （f）可知，当相机曝光时间低于自动曝光时间时，相机图像传感器因接收到的光子能量不足而造成成像视野暗，藻细胞与背景对比度差，难以分辨藻细胞；由图 6 6 （d）， 6 6 （h）可知，当相机曝光时间高于自动曝光时间时，相机图像传感器因接收到的光子能量过多而造成明场成像视野过亮丢失部分藻细胞细节或荧光成像背景噪点增多。相机自动曝光状态下如图 6 6 （b）， 6 6 （g）所示，相机自动曝光状态下成像较清晰，图像亮度在合理范围中 ［ 16 16 ］ ，因系统成像为显微成像方式，且藻细胞粒径较小，明场图像侧重获取藻细胞形态信息，为获取较亮视野提高藻细胞与背景对比度，确定明场最佳曝光时间为7 ms，如 图6 图6 （c）所示；为了提高荧光成像速度，加快拍摄效率，缩短曝光时间且获取清晰荧光图像，确定荧光最佳曝光时间为自动曝光时间350 ms，如 图6 图6 （g）所示，因此确定一个成像周期为707 ms。在此条件下，实验获取直链藻、多甲藻、栅藻、念珠藻、铜绿微囊藻等五种藻类的明场与荧光显微图像如 图7 图7 所示。 进一步提取 图7 图7 中不同藻细胞465 nm，620 nm荧光图像灰度亮度均值如 图8 图8 所示，分析发现，多甲藻，直链藻，栅藻在465 nm波段荧光图像荧光强度均高于620 nm波段获取的荧光强度，但465 nm与620 nm波段的荧光强度比例存在差异，分别为2.8，2.5和1.4；念珠藻、铜绿微囊藻620 nm波段荧光图像荧光强度远高于465 nm波段。这与已有研究结果相符 ［ 17 17 ］ ，即465 nm，620 nm荧光图像蕴含类色素组成信息，可辅助形态学进行藻种识别，提高形态相似藻种的识别准确率。 3.4　明场-荧光图像融合结果与分析 2 上述结果表明，双光路系统能够在707 ms内实现高分辨明场图像、465 nm和620 nm荧光图像同步采集。随机获取多甲藻、栅藻、念珠藻这三种藻类明场与荧光显微图像如 图9 图9 所示，结果表明明场图像与荧光图像无明显错位现象，结合基本图像配准技术 ［ 18 18 ］ ，可获得明场-荧光融合图像如 图9 图9 （d）所示。 进一步分析明场-荧光的融合图像如 图10 图10 所示，死亡藻细胞残留细胞壁和杂质均无荧光图像，如 图10 图10 中虚线框所示，据此可快速排除图像中的死藻细胞和杂质等干扰信息；活体藻细胞明场图像轮廓与荧光图像轮廓紧密贴合、边缘轮廓清晰，如 图10 图10 中实线框所示，可快速定位藻细胞位置和轮廓，提高藻细胞分割、提取和识别过程中的准确率。 5 结 论 1 本文使用高分辨率显微成像和双光路明场荧光同步成像方法，设计落射式与透射式结合的光源照明结构和后分光双通道成像结构，减少了不同模式拍摄时所需的延时和机械转动次数，实现浮游植物明场荧光高分辨率同步显微成像。结果表明，该系统分辨率可达1.5 μm，浮游植物明场图像、465 nm和620 nm荧光图像采集周期时间为707 ms；系统对不同粒径不同门类浮游植物显微图像进行采集，其中明场图像中包含藻细胞清晰的纹理颜色信息，荧光图像中包含明显边界特征的藻细胞色素分布信息，实现浮游植物显微图像丰富信息的获取；将浮游植物荧光图像与明场图像融合，验证了其可以排除水体杂质干扰，快速定位藻细胞位置。本文为快速获取藻细胞明场荧光显微图像信息提供一种系统结构和方法，并验证了该系统结构的可行性和成像效果，为藻细胞识别、藻细胞计数、细胞活性判断等研究提供了一种新技术手段。 参考文献 TANG D L ， DI B P ， WEI G F ， et al . Spatial， seasonal and species variations of harmful algal blooms in the South Yellow Sea and East China Sea ［J］. Hydrobiologia ， 2006 ， 568 （ 1 ）： 245 - 253 . doi: 10.1007/s10750-006-0108-1 http://dx.doi.org/10.1007/s10750-006-0108-1 Spatial， seasonal and species variations of harmful algal blooms in the South Yellow Sea and East China Sea KHAMMERI Y ， BELLAAJ-ZOUARI A ， HAMZA A ， et al . Ultraphytoplankton community composition in Southwestern and Eastern Mediterranean Basin： relationships to water mass properties and nutrients ［J］. Journal of Sea Research ， 2020 ， 158 ： 101875 . doi: 10.1016/j.seares.2020.101875 http://dx.doi.org/10.1016/j.seares.2020.101875 Ultraphytoplankton community composition in Southwestern and Eastern Mediterranean Basin： relationships to water mass properties and nutrients YANG S M ， LIU X S . Characteristics of phytoplankton assemblages in the southern Yellow Sea， China ［J］. Marine Pollution Bulletin ， 2018 ， 135 ： 562 - 568 . doi: 10.1016/j.marpolbul.2018.07.062 http://dx.doi.org/10.1016/j.marpolbul.2018.07.062 Characteristics of phytoplankton assemblages in the southern Yellow Sea， China EİDEMIR ， TURKOGLU M . Temporal variations of phytoplankton community and their correlation with environmental factors in the coastal waters of the Çanakkale Strait in 2018 ［J］. Oceanologia ， 2022 ， 64 （ 1 ）： 176 - 197 . doi: 10.1016/j.oceano.2021.10.003 http://dx.doi.org/10.1016/j.oceano.2021.10.003 Temporal variations of phytoplankton community and their correlation with environmental factors in the coastal waters of the Çanakkale Strait in 2018 BEDFORD J ， OSTLE C ， JOHNS DG ， et al . The influence of temporal scale selection on pelagic habitat biodiversity indicators ［J］. Ecological Indicators ， 2020 ， 114 ： 106311 . doi: 10.1016/j.ecolind.2020.106311 http://dx.doi.org/10.1016/j.ecolind.2020.106311 The influence of temporal scale selection on pelagic habitat biodiversity indicators 张军毅 ， 孙蓓丽 ， 朱冰川 ， 等 . 基于分子标记的藻类鉴定研究进展 ［J］. 湖泊科学 ， 2021 ， 33 （ 6 ）： 1607 - 1625 . doi: 10.18307/2021.0601 http://dx.doi.org/10.18307/2021.0601 基于分子标记的藻类鉴定研究进展 ZHANG J Y ， SUN B L ， ZHU B C ， et al . Research progress in the taxonomic identification of algae on the basis of molecular markers ［J］. Journal of Lake Sciences ， 2021 ， 33 （ 6 ）： 1607 - 1625 . （in Chinese） . doi: 10.18307/2021.0601 http://dx.doi.org/10.18307/2021.0601 Research progress in the taxonomic identification of algae on the basis of molecular markers COLTELLI P ， BARSANTI L ， EVANGELISTA V ， et al . Water monitoring： automated and real time identification and classification of algae using digital microscopy ［J］. Environmental Science Processes & Impacts ， 2014 ， 16 （ 11 ）： 2656 - 2665 . doi: 10.1039/c4em00451e http://dx.doi.org/10.1039/c4em00451e Water monitoring： automated and real time identification and classification of algae using digital microscopy WALKER R F ， ISHIKAWA K ， KUMAGAI M . Fluorescence-assisted image analysis of freshwater microalgae ［J］. Journal of Microbiological Methods ， 2002 ， 51 （ 2 ）： 149 - 162 . doi: 10.1016/s0167-7012(02)00057-x http://dx.doi.org/10.1016/s0167-7012(02)00057-x Fluorescence-assisted image analysis of freshwater microalgae HENSE B A ， GAIS P ， JÜTTING U ， et al . Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis ［J］. Journal of Plankton Research ， 2008 ， 30 （ 5 ）： 587 - 606 . doi: 10.1093/plankt/fbn024 http://dx.doi.org/10.1093/plankt/fbn024 Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis DEGLINT J L ， JIN C ， CHAO A ， et al . The feasibility of automated identification of six algae types using feed-forward neural networks and fluorescence-based spectral-morphological features ［J］. IEEE Access ， 2018 ， 7 ： 7041 - 7053 . doi: 10.1109/access.2018.2889017 http://dx.doi.org/10.1109/access.2018.2889017 The feasibility of automated identification of six algae types using feed-forward neural networks and fluorescence-based spectral-morphological features BI X ， LIN S ， ZHU S ， et al . Species identification and survival competition analysis of microalgae via hyperspectral microscopic images ［J］. Optik ， 2019 ， 176 ： 191 - 197 . doi: 10.1016/j.ijleo.2018.09.077 http://dx.doi.org/10.1016/j.ijleo.2018.09.077 Species identification and survival competition analysis of microalgae via hyperspectral microscopic images LAUFFER M ， GENTY F ， COLLETTE J L ， et al . Phytoplankton Identification by Combined Methods of Morphological Processing and Fluorescence Imaging ［C］. 2015 IEEE Workshop on Environmental， Energy， and Structural Monitoring Systems （EESMS） Proceedings . 9 - 10 ， 2015， Trento， Italy. IEEE ， 2015： 131 - 135 . doi: 10.1109/eesms.2015.7175865 http://dx.doi.org/10.1109/eesms.2015.7175865 Phytoplankton Identification by Combined Methods of Morphological Processing and Fluorescence Imaging 张朋涛 ， 杨西斌 ， 周伟 ， 等 . 双模切换显微内窥镜成像系统设计及应用 ［J］. 光学 精密工程 ， 2019 ， 27 （ 6 ）： 1335 - 1344 . doi: 10.3788/ope.20192706.1335 http://dx.doi.org/10.3788/ope.20192706.1335 双模切换显微内窥镜成像系统设计及应用 ZHANG P T ， YANG X B ， ZHOU W ， et al . Design and applied research of dual-mode switching endomicroscopic imaging system ［J］. Opt. Precision Eng. ， 2019 ， 27 （ 6 ）： 1335 - 1344 . （in Chinese） . doi: 10.3788/ope.20192706.1335 http://dx.doi.org/10.3788/ope.20192706.1335 Design and applied research of dual-mode switching endomicroscopic imaging system 王雪 ， 刘虹遥 ， 路鑫超 ， 等 . 无透镜全息显微细胞成像 ［J］. 光学 精密工程 ， 2020 ， 28 （ 8 ）： 1644 - 1650 . 无透镜全息显微细胞成像 WANG X ， LIU H Y ， LU X C ， et al . Cell imaging by holographic lens-free microscopy ［J］. Opt. Precision Eng. ， 2020 ， 28 （ 8 ）： 1644 - 1650 . （in Chinese） Cell imaging by holographic lens-free microscopy LU Q ， LIU G H ， XIAO C L ， et al . A modular， open-source， slide-scanning microscope for diagnostic applications in resource-constrained settings ［J］. PLoS One ， 2018 ， 13 （ 3 ）： e0194063 . doi: 10.1371/journal.pone.0194063 http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0194063 A modular， open-source， slide-scanning microscope for diagnostic applications in resource-constrained settings 缪新 ， 张运海 ， 黄维 . 皮肤反射式共聚焦显微成像自适应图像亮度调节 ［J］. 光学 精密工程 ， 2019 ， 27 （ 6 ）： 1270 - 1276 . doi: 10.3788/ope.20192706.1270 http://dx.doi.org/10.3788/ope.20192706.1270 皮肤反射式共聚焦显微成像自适应图像亮度调节 MIAO X ， ZHANG Y H ， HUANG W . Image brightness adaptive adjustment during skin imaging by reflectance confocal microscopy ［J］. Opt. Precision Eng. ， 2019 ， 27 （ 6 ）： 1270 - 1276 . （in Chinese） . doi: 10.3788/ope.20192706.1270 http://dx.doi.org/10.3788/ope.20192706.1270 Image brightness adaptive adjustment during skin imaging by reflectance confocal microscopy 殷高方 ， 赵南京 ， 胡丽 ， 等 . 基于色素特征荧光光谱的浮游植物分类测量方法 ［J］. 光学学报 ， 2014 ， 34 （ 9 ）： 0930005 . 基于色素特征荧光光谱的浮游植物分类测量方法 YIN G F ， ZHAO N J ， HU L ， et al . Classification and measurement method of phytoplankton based on pigment characteristic fluorescence spectrum ［J］. Acta Optica Sinica ， 2014 ， 34 （ 9 ）： 0930005 . （in Chinese） Classification and measurement method of phytoplankton based on pigment characteristic fluorescence spectrum 贾仁庆 ， 殷高方 ， 赵南京 ， 等 . 浮游藻类细胞显微明场图像与荧光同步测量图像配准方法研究 ［J］. 中国激光 ， 2022 ， 49 （ 24 ）： 80 - 87 . 浮游藻类细胞显微明场图像与荧光同步测量图像配准方法研究 JIA R Q ， YIN G F ， ZHAO N J ， et al . Registration method of microscopic bright field and fluorescence synchronous measurement images of phytoplankton cells ［J］. Chinese Journal of Lasers ， 2022 ， 49 （ 24 ）： 80 - 87 . （in Chinese） Registration method of microscopic bright field and fluorescence synchronous measurement images of phytoplankton cells 10.37188/OPE.20233112.1725 X832 A 1004-924X（2023）12-1725-10 徐敏,殷高方,赵南京等.浮游植物明场与荧光双光路同步成像方法[J].光学精密工程,2023,31(12):1725-1734. 徐敏,殷高方,赵南京等.浮游植物明场与荧光双光路同步成像方法[J].光学精密工程,2023,31(12):1725-1734. XU Min,YIN Gaofang,ZHAO Nanjing,et al.Simultaneous bright field and fluorescence dual optical path imaging of phytoplankton[J].Optics and Precision Engineering,2023,31(12):1725-1734. XU Min,YIN Gaofang,ZHAO Nanjing,et al.Simultaneous bright field and fluorescence dual optical path imaging of phytoplankton[J].Optics and Precision Engineering,2023,31(12):1725-1734. 安徽省科技重大专项资助项目（No.202203a07020002，No.202003a07020007）；国家自然科学基金资助项目（61875207，62005001）；深圳市可持续发展科技专项资助（No.KCXFZ20201221173007020） 2022-11-03 2022-12-07 2023-06-25 2023-07-17 39074611 光学精密工程 12 31